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胎兒染色體非整倍體（T21、T18、T13）
檢測試劑盒（高通量測序法）注冊技術(shù)
審查指導(dǎo)原則
本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊申請人對胎兒染色體非整倍體（T21、T18、T13）檢測試劑盒（高通量測序法）注冊申報資料的準備及撰寫，同時也為技術(shù)審評部門對注冊申報資料的技術(shù)審評提供參考。
本指導(dǎo)原則是針對該類試劑的一般要求，申請人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內(nèi)容進行充實和細化。
本指導(dǎo)原則是對申請人和審查人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規(guī)強制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要詳細闡明理由，并對其科學(xué)合理性進行驗證，提供詳細的研究資料和驗證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。
本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標準體系以及當(dāng)前認知水平下制定的，隨著法規(guī)和標準的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時進行調(diào)整。
一、范圍
胎兒染色體非整倍體（Fetal Chromosome Aneuploidies）中的21三體、18三體、13三體（Trisomies 21、Trisomies 18、Trisomies13，即T21、T18、T13）是臨床上最常見的染色體非整倍體疾病。其對應(yīng)的分別為21-三體綜合征（又稱唐氏綜合征，先天愚型或Down綜合征）、18-三體綜合征（又稱Edwards綜合征）和13-三體綜合征（又稱Patau綜合征），發(fā)病率分別約為1/700、1/6000、1/10000，患兒絕大多數(shù)存在嚴重智力障礙及器官畸形。
產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷是為避免產(chǎn)生遺傳缺陷患兒提供的手段。常規(guī)的產(chǎn)前篩查方法包括：早孕期的超聲與血清學(xué)聯(lián)合篩查和中孕期母體血清學(xué)篩查。篩查結(jié)果為高風(fēng)險的孕婦經(jīng)建議經(jīng)產(chǎn)前診斷進行最終確認，由孕婦知情選擇。胎兒染色體異常的產(chǎn)前診斷金標準為介入前產(chǎn)前診斷手術(shù),是指通過絨毛取材術(shù)/羊膜腔穿刺術(shù)/經(jīng)皮臍血管穿刺術(shù)，取相應(yīng)細胞采用細胞生物學(xué)方法對胎兒染色體進行核型分析。
高通量測序方法檢測胎兒染色體非整倍體的原理是：孕婦母體血漿中存在胎兒游離DNA（cell-free DNA，cfDNA），長度約為75bp—250bp，幾乎全部來源于胎盤的滋養(yǎng)層細胞，其濃度和孕周密切相關(guān)并以一定比例（5%—30%）穩(wěn)定存在于母體外周血漿中。高通量測序方法通過取母體血漿提取包含正常母體和胎兒的血漿游離DNA，經(jīng)文庫構(gòu)建，片段擴增等，最后進行上機測序，通過軟件分析數(shù)據(jù)獲得染色體數(shù)目評價結(jié)果。以檢測21三體綜合征為例，當(dāng)對懷有T21胎兒的母體血漿游離DNA數(shù)據(jù)進行分析時，其21號染色體游離DNA總數(shù)會有小比例的升高，通過統(tǒng)計學(xué)算法區(qū)分這一微小差異來實現(xiàn)利用cfDNA進行胎兒染色體非整倍體的產(chǎn)前篩查。但高通量測序法不能對染色體結(jié)構(gòu)異常進行檢測，不能代替?zhèn)鹘y(tǒng)篩查中的開放式神經(jīng)管缺陷篩查等。
本指導(dǎo)原則所述的胎兒染色體非整倍體（T21、T18、T13）檢測試劑盒（高通量測序法）是指通過高通量測序法檢測孕婦外周血血漿中胎兒游離脫氧核糖核酸（DNA），通過分析樣本中的胎兒游離DNA的21號、18號及13號染色體數(shù)量的差異，預(yù)期用于對胎兒染色體非整倍體疾病21-三體綜合征、18-三體綜合征和13-三體綜合征進行產(chǎn)前篩查的檢測試劑盒。
本指導(dǎo)原則所述的高通量測序法，是指通過文庫構(gòu)建、片段擴增進而進行上機測序的第二代測序方法，不需要進行片段擴增的第三代、第四代單分子測序方法在文中并未涉及。但高通量測序技術(shù)發(fā)展迅速，第三代、第四代單分子測序方法在企業(yè)內(nèi)部參考品設(shè)置、性能評估或臨床評價等處如有適用的方面，可以參照執(zhí)行。
本指導(dǎo)原則所述檢測試劑盒的適用人群為：對孕周為12+0周及以上的孕婦進行產(chǎn)前篩查，其結(jié)果不能代表對孕婦懷有三體胎兒的確認，產(chǎn)前篩查的結(jié)果必須要經(jīng)過產(chǎn)前診斷進行確認。
倫理學(xué)原則應(yīng)遵守國家相關(guān)法律法規(guī)及行業(yè)規(guī)定。
二、注冊申報資料要求
（一）綜述資料
綜述資料主要包括產(chǎn)品預(yù)期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說明、有關(guān)產(chǎn)品主要研究結(jié)果的總結(jié)和評價以及其他內(nèi)容。其中，其他內(nèi)容包括同類產(chǎn)品在國內(nèi)外批準上市的情況，應(yīng)著重從方法學(xué)及檢出限等方面寫明擬申報產(chǎn)品與目前市場上已獲批準的同類產(chǎn)品之間的主要區(qū)別。綜述資料應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊管理辦法》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號，以下簡稱《辦法》）和《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2014年第44號，以下簡稱“公告”）的相關(guān)要求。
綜述資料應(yīng)詳細闡明檢測原理，可配合圖示并寫明一個完整檢測配合使用的全部試劑及耗材名稱、生產(chǎn)廠家、貨號或注冊證書號以及詳細的組成成分。
（二）主要原材料的研究資料
主要原材料的研究資料包括企業(yè)內(nèi)部參考品和完成檢測所需試劑組成兩部分。
1.企業(yè)內(nèi)部參考品應(yīng)至少包括：陽性參考品、陰性參考品、檢測限參考品、嵌合體參考品，具體要求如下：
1.1陽性參考品：應(yīng)采用T21、T18、T13胎兒DNA片段按一定比例與正常女性血漿混合的模擬樣本。
1.2陰性參考品：應(yīng)包括采用染色體數(shù)目正常胎兒DNA片段按一定比例與正常女性血漿混合的模擬樣本，以及采用其他染色體異常胎兒DNA片段按一定比例與正常女性血漿混合的模擬樣本。其他染色體異常的陰性參考品由申請人依據(jù)常見染色體異常項目并根據(jù)對產(chǎn)品的質(zhì)控要求自行選擇。
1.3檢測限參考品：應(yīng)采用T21、T18、T13胎兒DNA片段按不同比例梯度與正常女性血漿混合的模擬樣本，如5%、3.5%、2.5%等，建議采用95%（n≥20）的陽性檢出率作為最低檢測限確定的標準。
1.4嵌合體參考品：由申請人按照對產(chǎn)品的質(zhì)控要求自行設(shè)定模擬T21、T18和T13嵌合體的組成比例，如70%異常，30%正常；30%異常，70%正常等。
T21、T18、T13及其他染色體異常胎兒DNA片段可由流產(chǎn)組織或羊水細胞、細胞系等來源制備。
申請人應(yīng)詳細說明企業(yè)內(nèi)部參考品的組成、詳細說明制備及檢定方法、胎兒DNA片段濃度確認方式和所占比例的選擇依據(jù)。組成各項企業(yè)內(nèi)部參考品的樣本應(yīng)為不同來源。
2.完成全部檢測流程所需試劑一般應(yīng)至少包括：血漿游離DNA提取純化試劑、文庫構(gòu)建試劑、文庫定量試劑、測序試劑、陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品以及與之配合使用的測序芯片和數(shù)據(jù)分析軟件。具體要求如下：
2.1血漿游離DNA提取純化試劑：無論申報產(chǎn)品中是否包含，申請人均應(yīng)提交配合使用的提取純化試劑的原理、詳細組成成分、生產(chǎn)廠家、貨號及第一類醫(yī)療器械備案憑證編號的相關(guān)資料。性能方面需對該試劑提取的DNA片段長度范圍準確性及純度要求，提取效率、重復(fù)性及抗干擾能力進行評估。
2.2文庫構(gòu)建試劑、文庫定量試劑、測序試劑：文庫構(gòu)建試劑對片段化的DNA進行缺口補平及相應(yīng)部分5’端磷酸化（如需）和3’端去磷酸化（如需），之后使用連接酶加上用于測序和分析的標簽和接頭，構(gòu)建成可以用來測序上機的標準文庫；文庫定量試劑通過PCR擴增及與標準品曲線的比對，用于定量測定文庫濃度，為后續(xù)均一化文庫進行上機測序做準備，同時能夠評估文庫構(gòu)建的質(zhì)量。文庫定量時應(yīng)明確對文庫質(zhì)量、片段大小及濃度要求，應(yīng)提供分析圖譜，對其中參數(shù)進行解釋說明（如是否有雜峰，產(chǎn)生的原因，是否對最終結(jié)果產(chǎn)生影響等）。文庫定量不限于上述方法，也可采用其他方法進行，如熒光染料法、Qubit定量等；測序試劑用于對均一化的文庫進行片段擴增，通過基因測序儀捕捉擴增過程中堿基的變化引起的信號變化來達到讀取序列的目的。
以上三種試劑一般由：相應(yīng)功能的酶（末端修復(fù)酶、DNA連接酶、缺口修復(fù)酶DNA聚合酶等）、核苷酸序列（引物、接頭序列、標簽序列、文庫定量標準品）、緩沖液及dNTP組成。具體要求如下：
2.2.1酶：應(yīng)提交純度、活性及功能性試驗資料。例如：文庫構(gòu)建過程包括但不限于末端修復(fù)酶、DNA連接酶、缺口修復(fù)聚合酶等，所選擇的酶應(yīng)當(dāng)具有末端突出削平、缺口補平、標簽或接頭連接、DNA聚合酶活性。
2.2.2核苷酸序列：應(yīng)提交相應(yīng)的序列組成和純度信息，序列準確度；引物設(shè)計應(yīng)提交引物設(shè)計原則及選擇對比依據(jù)。
2.2.3緩沖液：應(yīng)明確詳細的組成及各鹽濃度選擇對比的依據(jù)。
2.2.4 dNTP：包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP，應(yīng)提交對純度、濃度等的詳細驗證資料。
2.3陰、陽性質(zhì)控品：須能夠監(jiān)控DNA片段提取到最終測序結(jié)果全過程，因此應(yīng)當(dāng)由陰、陽性（T21、T18和T13）胎兒DNA片段按已知比例與正常女性血漿基質(zhì)混合組成。
2.4測序芯片：應(yīng)詳細闡明芯片進行片段擴增的原理及結(jié)構(gòu)，明確使用芯片型號，并對同一次測序芯片上樣的樣本間精密度進行評價。
2.5數(shù)據(jù)分析軟件：舉例介紹原始數(shù)據(jù)質(zhì)量評估、數(shù)據(jù)處理和篩選的方法，明確數(shù)據(jù)篩選依據(jù)以及使用的算法。
2.6提交不同原材料對于最終測序數(shù)據(jù)質(zhì)量影響的評估材料。由于各測序平臺的技術(shù)側(cè)重點不同，數(shù)據(jù)質(zhì)量評估的項目可能存在差異，需考慮包括但不限于以下方面：文庫濃度、文庫片段大小、單樣本總序列數(shù)（數(shù)據(jù)量）、唯一比對率、單次檢測的GC gap（最高GC值與最低GC值的差值）等。
2.7除上述資料，申請人還應(yīng)提交主要原材料的篩選依據(jù)及試驗資料。如為自制，則應(yīng)提交：制備方法、質(zhì)量要求、質(zhì)量檢測方法、對比篩選的試驗資料等；如為外購，則應(yīng)提交：外購證書、質(zhì)量要求、質(zhì)量檢測方法、對比篩選的試驗資料等。其中，對比篩選的試驗資料應(yīng)包括篩選過程中的數(shù)據(jù)、圖譜、對比圖表等信息。
（三）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料
1.主要生產(chǎn)工藝包括配制工作液、半成品檢定、分裝和包裝。配制工作液的各種原材料及其配比應(yīng)符合要求，原材料應(yīng)混合均勻，配制過程應(yīng)對關(guān)鍵參數(shù)進行有效控制。所提交申報資料中應(yīng)包括主要生產(chǎn)工藝介紹和生產(chǎn)工藝流程圖，后者需標明關(guān)鍵工藝質(zhì)控步驟，并詳細說明該步驟的質(zhì)控方法及質(zhì)控標準。
2.反應(yīng)體系研究指完成檢測所涉及到的最佳反應(yīng)條件的選擇確定過程，包括對提取純化步驟、游離DNA片段的末端修復(fù)、接頭及標簽連接、文庫定量、片段擴增、測序反應(yīng)的反應(yīng)條件及反應(yīng)體系的選擇確定，涉及到對樣本類型、樣本用量、試劑用量、緩沖體系的選擇、反應(yīng)溫度和時間條件及檢測過程中質(zhì)控方法確定的依據(jù)。重點關(guān)注：酶濃度、引物濃度、dNTP濃度、離子濃度、加樣量及反應(yīng)體積、片段擴增各階段溫度、時間及循環(huán)數(shù)、測序數(shù)據(jù)質(zhì)量的評估指標等，其中加樣量和反應(yīng)體積應(yīng)參考相應(yīng)行業(yè)標準，經(jīng)研究驗證后確定。
此外，還應(yīng)對數(shù)據(jù)量及胎兒游離DNA濃度和比例對檢測結(jié)果的影響進行研究。
（四）分析性能評估資料
申請人應(yīng)提交產(chǎn)品在產(chǎn)品研制或成品驗證階段對試劑盒進行的全部性能的評估資料，對于每項分析性能的評價都應(yīng)包括研究目的、實驗設(shè)計、研究方法、可接受標準、實驗數(shù)據(jù)、統(tǒng)計方法等詳細資料。有關(guān)分析性能評估的背景信息也應(yīng)在申報資料中有所體現(xiàn)，包括實驗地點（實驗室）、人員及數(shù)量、適用儀器、試劑規(guī)格、批號、臨床樣本來源（如涉及）等。分析性能評估的實驗方法可以參考相關(guān)的美國臨床實驗室標準化協(xié)會批準指南（CLSI-EP）文件或國內(nèi)有關(guān)體外診斷產(chǎn)品性能評估的指導(dǎo)原則進行。建議著重對以下分析性能進行研究：
1.最低檢出限：建議使用企業(yè)參考品進行梯度稀釋并多次檢測，將具有95%陽性檢出率的胎兒游離DNA濃度水平作為最低檢出限。企業(yè)參考品應(yīng)使用公認的準確定量方法進行，最低檢出限應(yīng)描述為XX DNA濃度下可檢出胎兒DNA的最小百分比。
2.企業(yè)內(nèi)部參考品符合率：對試劑檢測企業(yè)內(nèi)部參考品的符合情況進行評估。
3.精密度：精密度的評價方法并無統(tǒng)一的標準可依，可根據(jù)不同產(chǎn)品特征或企業(yè)的研究習(xí)慣進行，前提是必須保證研究的科學(xué)合理性，具體實驗方法可以參考相關(guān)的美國臨床實驗室標準化協(xié)會批準指南（CLSI-EP）或國內(nèi)有關(guān)體外診斷產(chǎn)品性能評估的指導(dǎo)原則進行。企業(yè)應(yīng)對每項精密度指標的評價標準做出合理要求，如標準差或變異系數(shù)的范圍等。針對本類產(chǎn)品的精密度評價主要包括以下要求：
3.1對可能影響檢測精密度的主要變量進行驗證，除檢測試劑（包括核酸分離/純化組分）本身的影響外，應(yīng)對高通量基因測序儀、操作者、地點、合理的精密度評價周期等要素進行相關(guān)的驗證。
例如：為期至少XX天的連續(xù)檢測，每天至少由2人完成不少于2次的完整檢測，從而對批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間的精密度進行綜合評價。申請人還應(yīng)選擇不同的實驗室進行重復(fù)實驗以對室間精密度進行評價。
3.2用于精密度評價的模擬樣品和臨床樣本均應(yīng)至少包含3個水平：陰性樣品、臨界陽性樣品、（中或強）陽性樣品，并根據(jù)產(chǎn)品特性設(shè)定適當(dāng)?shù)木芏纫蟆＞芏仍u價中的每一次檢測均應(yīng)從核酸提取開始。
4.干擾試驗：包括內(nèi)源性干擾物質(zhì)和外源性干擾物質(zhì)。應(yīng)針對可能存在的干擾情況進行驗證。建議申請人在干擾物質(zhì)的潛在最大濃度(即“最差條件”)條件下進行評價。內(nèi)源性干擾物質(zhì)的評價至少應(yīng)包括膽紅素、游離血紅蛋白、甘油三酯。
5.特異性：對以下是否干擾T21、T18、T13陰陽性的檢出能力進行評價：
5.1微缺失、微重復(fù)評價：申請人應(yīng)采用一定比例的微缺失、微重復(fù)胎兒DNA與正常女性血漿混合制備微缺失、微重復(fù)模擬樣本進行評價。
5.2嵌合體評價：申請人應(yīng)采用不同嵌合比例的模擬T21、T18和T13嵌合體樣本對試劑檢測嵌合體的能力進行評估，對不能檢測到的模擬嵌合體的嵌合比例進行確認。
5.3對其他常見染色體樣本的干擾進行評價。
微缺失微重復(fù)模擬樣本、嵌合體模擬樣本及其他常見染色體樣本的類型和數(shù)量由申請人選擇確定，并在產(chǎn)品說明書中明確。
（五）陽性判斷值的確定資料
由于目前胎兒染色體非整倍體T13、T18、T21的陽性判斷值存在多種計算方式，且更好的算法和數(shù)據(jù)處理方式仍在不斷開發(fā)中。因此，如申請人選擇了某一算法作為陽性判斷值的計算方式，則應(yīng)詳細闡述選擇該算法作為陽性判斷值依據(jù)的原因（如權(quán)威文獻、行業(yè)共識等），并詳細闡述計算公式和各參數(shù)代表的意義。
以大樣本量常用的Z-值（Z-score）算法來舉例說明：
1.Z-值這個統(tǒng)計量反應(yīng)的是當(dāng)前數(shù)值距離平均數(shù)的相對標準距離，Z-值的應(yīng)用條件為大樣本量以及數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，計算公式如下：
1.1chrN z-score for test sample:所檢測樣本的Z-值；
1.2 N：指定的第N染色體；
1.3%chrNsample：待測樣品第N條染色體唯一比對序列數(shù)占常染色體的百分比，通過高通量測序后軟件分析獲得；
1.4 Mean%chrNreference：參照樣品第N條染色體比例平均值；
1.5S.D.%chrNreference：參照樣品第N 條染色體比例的標準偏差。
該公式中，影響唯一比對序列的因素包括GC含量、檢驗覆蓋度等，申請人應(yīng)計算并統(tǒng)計檢驗覆蓋度是否在正常范圍內(nèi)。參照樣品的數(shù)量、來源等均對其數(shù)據(jù)產(chǎn)生影響，進而影響Mean%chrNreference和S.D.%chrNreference。因此，申請人需對參照樣品的數(shù)據(jù)計算進行詳述，并提供計算值。
2.被篩查孕婦所懷胎兒的染色體數(shù)量狀況符合正態(tài)分布，即大概率為正常染色體數(shù)量，小概率事件為胎兒染色體非整倍體，如圖1所示：
圖1 正態(tài)分布圖
如圖1可以看出，出現(xiàn)在Z-值為正負3以外的數(shù)值，則有99.9%的可能為陽性，因此，通常將Z-值=3定為陽性判斷值分界點，Z-值>3或Z-值<-3判斷為胎兒染色體非整倍體陽性。 申請人應(yīng)當(dāng)根據(jù)試驗對Z-值>3及Z-值<-3的情況分別進行說明。
鑒于并無100%陰陽性分界點，一般來說，申請人應(yīng)設(shè)定陽性判斷值灰區(qū)范圍，灰區(qū)的設(shè)定應(yīng)提交理論和實際試驗結(jié)果的依據(jù)，并在說明書【陽性判斷值】和【檢驗結(jié)果的解釋】項進行解釋說明，如：是否需要用產(chǎn)前診斷的方式進行最終確認，可能的原因，是否需要孕齡再大時進行再次抽血復(fù)測等等。如無灰區(qū)設(shè)置，也應(yīng)提交理論和大樣本量試驗結(jié)果的依據(jù)。
在陽性判斷值設(shè)定后，申請人應(yīng)當(dāng)選取一定數(shù)量陰、陽性真實臨床樣本進行試驗驗證，如與該公式不符，則應(yīng)說明出現(xiàn)的問題及詳細的數(shù)據(jù)校正方式。
（六）穩(wěn)定性研究資料
穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實施方案、詳細的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。主要涉及兩部分內(nèi)容，申報產(chǎn)品的穩(wěn)定性和適用樣本的穩(wěn)定性研究。
1.申報產(chǎn)品的穩(wěn)定性研究主要包括實時穩(wěn)定性（有效期）、運輸穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制等研究。對于實時穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。
2.適用樣本的穩(wěn)定性研究主要包括對含有游離DNA的孕婦血漿的保存、冷藏和冷凍條件下的有效期驗證以及血漿游離DNA提取后儲存條件的驗證。可以在合理的溫度范圍內(nèi)選擇溫度點（溫度范圍），每間隔一定的時間段對儲存樣本進行檢測，從而確認樣本的穩(wěn)定性。適于冷凍保存的樣本還應(yīng)對凍融次數(shù)進行評價。
應(yīng)注意運輸穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性等研究實際上均指經(jīng)運輸或開瓶后對產(chǎn)品效期及檢測性能是否有影響，因此申請人應(yīng)在試驗設(shè)計中充分考慮上述因素。此外，產(chǎn)品穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性兩部分內(nèi)容的研究結(jié)果均應(yīng)在說明書【儲存條件及有效期】和【樣本要求】兩項中進行詳細說明。
（七）產(chǎn)品技術(shù)要求
擬定產(chǎn)品技術(shù)要求應(yīng)符合《辦法》、“公告”和《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第9號）的相關(guān)要求。
如果擬申報試劑已有相應(yīng)的國家/行業(yè)標準發(fā)布，則企業(yè)標準的要求不得低于上述標準要求。
（八）產(chǎn)品注冊檢驗報告
根據(jù)總局第5號令要求，首次申請注冊的第三類產(chǎn)品應(yīng)在國家食品藥品監(jiān)督管理局認可的、具有相應(yīng)承檢范圍的醫(yī)療器械檢測機構(gòu)進行連續(xù)三個生產(chǎn)批次樣品的注冊檢驗。該產(chǎn)品已有國家參考品發(fā)布，在注冊檢驗時應(yīng)使用“高通量測序用外周血胎兒染色體非整倍體（T21、T18和T13）國家參考品”進行。
（九）產(chǎn)品說明書
產(chǎn)品說明書的格式應(yīng)符合《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第17號）的要求，進口產(chǎn)品的中文說明書除格式要求外，其內(nèi)容應(yīng)盡量保持與原文說明書的一致性，翻譯力求準確且符合中文表達習(xí)慣。產(chǎn)品說明書的所有內(nèi)容均應(yīng)與申請人提交的注冊申報資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻，則應(yīng)以規(guī)范格式對此內(nèi)容進行標注，并單獨列明參考文獻的相關(guān)信息。
結(jié)合《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》的要求，下面對說明書的重點內(nèi)容進行詳細說明。
1.【產(chǎn)品名稱】
建議按照如下方式命名：胎兒染色體非整倍體（T21、T18、T13）檢測試劑盒（方法學(xué)）或胎兒染色體非整倍體（T21/T18/T13）檢測試劑盒（方法學(xué)）。
舉例：胎兒染色體非整倍體（T21、T18、T13）檢測試劑盒（半導(dǎo)體測序法）、胎兒染色體非整倍體（T21/T18/T13）檢測試劑盒（可逆末端終止測序法）。
2.【預(yù)期用途】
2.1第一自然段：預(yù)期用途描述，包括被測孕婦孕周特征，樣本類型等。
舉例：該產(chǎn)品用于定性檢測孕周為12+0周及以上的孕婦外周血血漿中胎兒游離脫氧核糖核酸（DNA），通過分析樣本中的胎兒游離DNA的21號、18號及13號染色體數(shù)量的差異，對胎兒染色體非整倍體疾病21-三體綜合征、18-三體綜合征和13-三體綜合征進行產(chǎn)前篩查。如試劑盒僅是測序步驟中的建庫步驟，則預(yù)期用途應(yīng)描述為“構(gòu)建測序文庫”。
2.2第二自然段：按照《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》介紹臨床適應(yīng)癥及背景，說明相關(guān)的臨床或?qū)嶒炇以\斷方法等，應(yīng)介紹產(chǎn)前診斷金標準。
2.3第三自然段：明確該產(chǎn)品僅作為21號、18號及13號染色體的產(chǎn)前篩查用途，其結(jié)果要由產(chǎn)前診斷金標準進行確認并遵守相關(guān)法律法規(guī)及行業(yè)規(guī)范。
3.【檢驗原理】
詳細說明該產(chǎn)品檢測母體胎兒游離DNA判斷染色體數(shù)量的檢測原理及方法學(xué)原理（必要時可用圖示進行）。
4.【主要組成成分】
說明試劑盒所包含組分的名稱、數(shù)量、比例或濃度等信息，說明不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。
試劑盒中不包含但該項檢測必需的組分，說明書中應(yīng)列出相關(guān)試劑/耗材的名稱、生產(chǎn)企業(yè)、貨號、注冊證號/第一類醫(yī)療器械備案憑證編號（如有）及其他相關(guān)信息，測序芯片應(yīng)明確型號。
5.【儲存條件及有效期】
5.1按照穩(wěn)定性研究資料，說明試劑盒的效期穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性、復(fù)溶穩(wěn)定性、運輸穩(wěn)定性、凍融次數(shù)要求等，應(yīng)標明具體的儲存條件及效期。
5.2按照《醫(yī)療器械說明書和標簽管理規(guī)定》（總局令第5號）增加生產(chǎn)日期，使用期限或者失效日期。
6.【樣本要求】
6.1樣本采集要求。
6.2說明對采血管及抗凝劑的要求。
6.3樣本保存、運輸及處理：孕婦外周血樣本的保存條件（溫度、保質(zhì)期限）、運輸條件、處理條件（如：多長時間內(nèi)必須分離血漿）；已分離的血漿樣本的保存條件（溫度、保質(zhì)期限）、運輸條件、處理條件（如：核酸提取前的預(yù)處理）；冷藏/冷凍樣本檢測前是否需恢復(fù)至室溫，凍融次數(shù)的要求。
上述內(nèi)容均需在穩(wěn)定性研究資料中詳述并用產(chǎn)品進行性能評估驗證。
7.【適用機型】
適用的測序儀器具體型號，并提供與儀器有關(guān)的重要信息以指導(dǎo)用戶操作。
8.【檢驗方法】
無論是否包含提取試劑或測序試劑，申請人應(yīng)從頭詳細描述完成完整檢測所需的全部步驟以指導(dǎo)用戶正確操作，包括血漿游離DNA的提取、文庫構(gòu)建、文庫定量、片段擴增及上機測序。該類產(chǎn)品操作程序較多，作為產(chǎn)品使用說明書該項內(nèi)容應(yīng)當(dāng)盡量詳細，以能夠指導(dǎo)用戶進行操作，其中應(yīng)當(dāng)包括各步驟的注意事項及配合使用物品的技術(shù)參數(shù)、儀器廠家和型號（如PCR儀，生物分析儀等）和反應(yīng)條件，以半導(dǎo)體測序為例：
8.1 DNA提取：DNA提取方式、提取試劑盒貨號及第一類醫(yī)療器械備案憑證編號；DNA提取液的短期和長期保存方式、凍融次數(shù)等。
8.2文庫構(gòu)建：末端修復(fù)、接頭連接、缺口修復(fù)、PCR擴增；所構(gòu)建的文庫短期和長期保存方式，凍融次數(shù)等。
8.3文庫定量；描述對于定量后文庫濃度和質(zhì)量的要求，以及何種情況進行文庫的重新構(gòu)建。
8.4測序模板的制備：混合文庫、PCR、模板富集。
8.5上機測序：儀器準備、設(shè)置及儀器使用相關(guān)參數(shù)。
9.【陽性判斷值】
明確設(shè)定陽性判斷值所使用的算法及驗證參考值所使用的樣本例數(shù)及類型。如使用軟件，則應(yīng)明確軟件名稱、唯一標識號、生產(chǎn)廠家及醫(yī)療器械注冊證書編號；如暫未取得醫(yī)療器械注冊證書，應(yīng)空出相應(yīng)內(nèi)容，在軟件名稱后注明（醫(yī)療器械注冊證書編號：）。
10.【檢驗方法的局限性】
10.1 本試劑盒作為胎兒染色體非整倍體篩查檢測，其結(jié)果僅供臨床參考，不能作為診斷的唯一依據(jù)。對患者的臨床診斷應(yīng)采用金標準方法（染色體核型分析）并結(jié)合其癥狀/體征、病史及其他實驗室檢查等情況綜合進行。本試劑盒不能對胎兒染色體結(jié)構(gòu)異常進行檢測。
10.2 本試劑盒適用于孕婦外周血血漿樣本檢測，不適用于其它樣本檢測。
10.3 胎兒游離DNA濃度在孕婦外周血中存在較大個體差異，變化范圍從2%到30%不等且和孕周密切相關(guān)，因此若因胎兒游離DNA濃度較低造成檢驗失敗時，可待孕周較大時再次抽血檢測。
10.4以下幾種情況的孕婦樣品可能會出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果，需要結(jié)合其他檢測結(jié)果進行綜合判斷：
10.4.1孕婦本人為染色體非整倍體疾病患者、其他染色體疾病患者或攜帶者；
10.4.2胎兒染色體異常中的平衡易位、嵌合型三體異常；
10.4.3懷有雙胎或者多胎（三胎及三胎以上）的孕婦；
10.4.4近期接受過移植手術(shù)、干細胞治療；近期接受過免疫治療或輸注過異體血制品；
10.4.5孕婦本人為腫瘤患者；
10.4.6通過體外受精—胚胎移植（IVF-ET）方式受孕的孕婦；
10.4.7體重嚴重超重的孕婦。
10.5樣本采集、運輸及處理不當(dāng)、未按說明書操作均有可能導(dǎo)致假陽性或假陰性結(jié)果；描述在樣本采集，保存、運輸中需遵循的原則及注意事項，例如：
10.5.1描述適用的抗凝采血管；
10.5.2顛倒混勻時動作應(yīng)輕柔，防止溶血；
10.5.3全血離體后須進行血漿分離的時間；
10.5.4血漿分離過程中注意不要吸到中間層的白細胞；
10.5.5血漿樣本是否能夠進行反復(fù)凍融；
10.5.6禁止將XX抗凝樣本和血漿樣本在室溫狀態(tài)下放置；
10.5.7血漿樣本寄送采用的運輸保存方式。
10.6 其他局限性。
11.【產(chǎn)品性能指標】
按照分析性能評估資料內(nèi)容詳述以下性能指標：最低檢出限、企業(yè)內(nèi)部參考品符合率、精密度、干擾試驗、特異性。各項評估應(yīng)包括評估方法、數(shù)據(jù)和結(jié)果。應(yīng)將臨床評價的試驗結(jié)果納入，包括臨床試驗機構(gòu)數(shù)量、樣本例數(shù)、試驗結(jié)果等內(nèi)容。
（十）臨床評價資料
1.研究方法
對照方法：依據(jù)衛(wèi)生部（現(xiàn)國家衛(wèi)生與計劃生育委員會）發(fā)布的“《WS322.2-2010胎兒染色體異常與開放性神經(jīng)管缺陷的產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)標準》第2部分:胎兒常見染色體異常的細胞遺傳學(xué)產(chǎn)前診斷技術(shù)標準”，以介入性產(chǎn)前診斷手術(shù)結(jié)果（包括絨毛取材術(shù)、羊膜腔穿刺術(shù)和經(jīng)皮臍血管穿刺術(shù)）和出生隨訪結(jié)果作為確診胎兒染色體非整倍體T21、T18、T13的對照金標準。對于出生隨訪，應(yīng)在方案中明確隨訪由新生兒醫(yī)師進行，各機構(gòu)在制定方案中對醫(yī)師進行統(tǒng)一的培訓(xùn)，采用科學(xué)的、統(tǒng)一的評價標準和評價項目（應(yīng)當(dāng)提供依據(jù)）對出生后嬰兒表觀進行是否是三體患兒的診斷，也可采用出生后采血進行核型分析的方式進行診斷。
研究方法為前瞻性研究，是指對臨床需要正常進行產(chǎn)前診斷的孕婦采集樣本與金標準檢測進行對比分析。
統(tǒng)計學(xué)分析一般選用交叉四格表的形式總結(jié)本試劑盒測序結(jié)果和金標準檢測結(jié)果并進行卡方或kappa檢驗，與金標準比對進行敏感性、特異性分析，計算陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值。對于以上統(tǒng)計值，均應(yīng)做統(tǒng)計假設(shè)，并報告95%置信區(qū)間。
2.臨床研究機構(gòu)及人員
臨床研究機構(gòu)應(yīng)為已取得產(chǎn)前診斷技術(shù)服務(wù)資質(zhì)的醫(yī)療機構(gòu)。人員應(yīng)為經(jīng)過專門培訓(xùn)的取得資質(zhì)的人員。機構(gòu)和人員應(yīng)遵循《產(chǎn)前診斷技術(shù)管理辦法》《母嬰保健專項技術(shù)服務(wù)許可及人員資格管理辦法》，機構(gòu)取得《母嬰保健技術(shù)服務(wù)執(zhí)業(yè)許可證》，人員取得《母嬰保健技術(shù)考核合格證書》。
3.適用人群及樣本量
適用人群為孕周為12+0周及以上的孕婦。不同年齡段孕婦應(yīng)按自然比例分布，35歲及以上孕婦占比應(yīng)控制在10%—15%。樣本量依據(jù)統(tǒng)計學(xué)及胎兒染色體三體發(fā)病率計算，根據(jù)其臨床預(yù)期用于產(chǎn)前篩查的用途，按照發(fā)病率計算建議總例數(shù)不少于10000例。
試驗要求能夠篩選出一定數(shù)量的T21陽性、至少1例的T18陽性和至少1例的T13陽性。如未篩查出符合要求的陽性病例數(shù)量，則應(yīng)繼續(xù)增加樣本例數(shù)進行篩查，所有樣本均應(yīng)可以溯源。
4.其他要求
4.1對于臨床試驗中可能會出現(xiàn)用于核型分析的細胞培養(yǎng)不出導(dǎo)致數(shù)據(jù)缺失的情況：密切關(guān)注該病例并建議孕婦做二次穿刺，最終確定結(jié)果可納入統(tǒng)計分析；
4.2關(guān)于失訪率的要求：核型分析屬于有創(chuàng)檢測，如孕婦拒絕二次穿刺將導(dǎo)致數(shù)據(jù)失訪；出生隨訪可能有部分數(shù)據(jù)失訪。因此，可接受的失訪率應(yīng)控制在高危孕婦≤2%，低危孕婦≤10%，且失訪數(shù)據(jù)應(yīng)說明原因。
4.3臨床試驗結(jié)果的客觀內(nèi)容（包括失訪率等）建議在產(chǎn)品說明書中明示。
5.臨床試驗方案
5.1申請人按照上述1—4要求并結(jié)合體外診斷試劑注冊申報相關(guān)法規(guī)制定臨床試驗方案。需遵循如下要點：
5.1.1各臨床研究機構(gòu)的方案應(yīng)基本一致，且保證在整個臨床試驗過程中遵循預(yù)定的方案實施，不可隨意改動。臨床試驗方案的修改過程和版本要記錄在案，且每次改動應(yīng)記錄原因。
5.1.2整個試驗過程應(yīng)在臨床研究機構(gòu)的實驗室內(nèi)并由本實驗室的技術(shù)人員操作完成，申報單位的技術(shù)人員除進行必要的技術(shù)指導(dǎo)外，不得隨意干涉實驗進程，尤其是數(shù)據(jù)收集過程。
5.2臨床試驗方案還應(yīng)詳細闡述如下內(nèi)容：
5.2.1臨床研究單位選擇、臨床主要研究人員簡介；對臨床試驗的整體管理情況、質(zhì)量控制、試驗人員培訓(xùn)、儀器日常維護、儀器校準、質(zhì)控品運行的規(guī)定。
5.2.2臨床背景、病例納入/排除標準、樣本的預(yù)期選擇例數(shù)及標準。其中須注意，病例納入/排除標準應(yīng)嚴格制定并實施，任何已經(jīng)入選的病例再被排除出臨床研究都應(yīng)記錄在案并明確說明原因。在試驗操作過程中和判定試驗結(jié)果時應(yīng)采用盲法以保證試驗結(jié)果的客觀性，對于編盲的方式應(yīng)有詳細描述。
5.2.3如采用出生隨訪方式，則應(yīng)對出生隨訪的依據(jù)、項目及判定標準進行詳細規(guī)定，包括但不限于如下內(nèi)容：隨訪操作及記錄人員、復(fù)核人員、隨訪方式、隨訪項目、判定依據(jù)、隨訪時間周期及間隔、隨訪終點等。
5.2.4樣本類型、樣本的收集、處理及保存等。
5.2.5數(shù)據(jù)預(yù)處理、統(tǒng)計學(xué)方法、統(tǒng)計軟件、評價統(tǒng)計結(jié)果的標準。
6.臨床試驗報告
臨床實驗報告包括各機構(gòu)的臨床試驗報告以及臨床總結(jié)報告。根據(jù)《體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第16號）的要求，臨床試驗報告應(yīng)該與方案呼應(yīng)并相一致，對方案執(zhí)行情況及試驗結(jié)果進行詳述：
6.1樣本例數(shù)（總結(jié)報告應(yīng)為各機構(gòu)的樣本例數(shù)、陽性檢出例數(shù)等）、孕婦年齡分布情況、建議以列表方式給出具體例數(shù)及百分比。
6.2對檢測精密度、質(zhì)控品測量值的抽查結(jié)果評估。
6.3具體試驗過程及試驗過程中需要說明的問題，研究過程中是否涉及對方案的修改。
6.4申報試劑批號、有效期及所用機型等信息，配合使用的試劑、耗材及儀器的廠商信息、貨號及產(chǎn)品醫(yī)療器械注冊證編號。需要強調(diào)的是：臨床試驗研究應(yīng)使用與說明書描述一致的配套使用試劑及儀器。
6.5統(tǒng)計學(xué)分析：樣本的納入與排除情況；數(shù)據(jù)預(yù)處理、差異數(shù)據(jù)的重新檢測與否以及最終是否納入數(shù)據(jù)統(tǒng)計、對異常值或缺失值的處理。另外考慮到對不同年齡段孕婦樣本的陽性檢出率可能存在一定差異，故建議對不同年齡段孕婦樣本分別進行統(tǒng)計分析。
6.6討論和結(jié)論：對總體結(jié)果進行總結(jié)性描述并分析試驗結(jié)果，對本次臨床研究有無特別說明，最后得出臨床試驗結(jié)論。
6.7病例報告表應(yīng)包括如下信息：孕婦代碼、年齡、金標準分析具體結(jié)果、該試劑檢測結(jié)果。其中金標準分析如為核型分析，應(yīng)明確具體結(jié)果；如為出生隨訪，則應(yīng)明確胎兒出生時間、隨訪時間、隨訪方式、隨訪結(jié)果。病例報告表的全部數(shù)據(jù)應(yīng)可溯源。
7.上市后需完成的工作
上市后需繼續(xù)搜集至少10家臨床機構(gòu)、總數(shù)不少于10萬例臨床使用數(shù)據(jù)作為臨床補充資料在產(chǎn)品下一次延續(xù)注冊時提交，并使用該試劑檢測的全部結(jié)果（包括陰性、陽性）與衛(wèi)生主管部門關(guān)于胎兒染色體產(chǎn)前診斷技術(shù)標準以羊水穿刺核型分析或出生隨訪結(jié)果作為金標準進行對照。對于出現(xiàn)在灰區(qū)（如適用）的樣本（Z值臨界值區(qū)域）應(yīng)進行分析總結(jié)。該項臨床資料應(yīng)當(dāng)由出具數(shù)據(jù)各臨床機構(gòu)主管部門簽章。此外，注冊人還應(yīng)總結(jié)上市期間假陽性和假陰性的例數(shù)并詳細分析產(chǎn)生原因。
在延續(xù)注冊時，注冊人應(yīng)依據(jù)上市后的臨床使用數(shù)據(jù)進一步修訂說明書臨床性能相關(guān)內(nèi)容。
三、名詞解釋
1.高危孕婦
本指導(dǎo)原則中是指建議實行產(chǎn)前診斷的人群：35歲以上的高齡孕婦；產(chǎn)前篩查出來的胎兒染色體異常高風(fēng)險的孕婦；曾生育過染色體病患兒的孕婦；產(chǎn)前B超檢查懷疑胎兒可能有染色體異常的孕婦；夫婦一方為染色體異常攜帶者；醫(yī)師認為有必要進行產(chǎn)前診斷的其他情形。
2.低危孕婦
本指導(dǎo)原則中是指除去定義為高危孕婦以外的孕婦人群。
四、參考文獻
1．《產(chǎn)前診斷技術(shù)管理辦法》（中華人民共和國衛(wèi)生部令第33號），2002年12月13日。
2．《孕婦外周血胎兒游離DNA產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)規(guī)范》（國衛(wèi)辦婦幼發(fā)〔2016〕45號），2016年11月9日。
3．中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準（WS 322.1-2010），胎兒常見染色體異常與開放性神經(jīng)管缺陷的產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)標準第1部分：中孕期母血清學(xué)產(chǎn)前篩查。
4．中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準（WS 322.2-2010），胎兒常見染色體異常與開放性神經(jīng)管缺陷的產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)標準第2部分：胎兒染色體異常的細胞遺傳學(xué)產(chǎn)前診斷技術(shù)標準。
5．Cell-free DNA Screening for Fetal Aneuploidy,ACOG, 2015.
6．Noninvasive prenatal screening for fetal aneuploidy, 2016 update, ACMG, 2016.
7．Position Statement from the Chromosome Abnormality Screening Committee on Behalf of the Board of the international Society for Prenatal Diagnosis, ISPD, 2015.
8．Guidelines for diagnostic next-generation sequencing, guidelines for the evaluation and validation, EuroGentest and the European Society of Human Genetics, 2016.
9．Use of Standards in FDA Regulatory Oversight of Next Generation Sequencing (NGS)-Based In Vitro Diagnostics (IVDs) Used for Diagnosing Germline Diseases, Draft Guidance for Stakeholders and Food and Drug Administration Staff, FDA, 2016.
10．《出生缺陷防治報告》，中華人民共和國衛(wèi)生部，2012。
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