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腫瘤個體化治療相關基因突變檢測試劑
技術審查指導原則
本指導原則旨在指導注冊申請人對腫瘤個體化治療相關基因突變檢測試劑注冊申報資料的準備及撰寫，同時也為技術審評部門對注冊申報資料的技術審評提供參考。
本指導原則是針對腫瘤個體化治療相關基因突變檢測試劑的一般要求，申請人應依據產品的具體特性確定其中內容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應的科學依據，并依據產品的具體特性對注冊申報資料的內容進行充實和細化。
本指導原則是對申請人和審查人員的指導性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規強制執行，如果有能夠滿足相關法規要求的其他方法，也可以采用，但需要詳細闡明理由，并對其科學合理性進行驗證，提供詳細的研究資料和驗證資料，相關人員應在遵循相關法規的前提下使用本指導原則。
本指導原則是在現行法規和標準體系以及當前認知水平下制定的，隨著法規和標準的不斷完善，以及科學技術的不斷發展，本指導原則相關內容也將適時進行調整。
一、范圍
本指導原則所述腫瘤個體化治療相關基因突變檢測試劑是指利用基于聚合酶鏈式反應（PCR）方法的核酸檢測技術，以腫瘤個體化治療相關的突變基因為檢測目標，對人體樣本（包括組織、體液等）提取的核酸組分中的目標序列進行體外檢測的試劑。
本指導原則所指基因突變的類型包括置換、插入、缺失、基因重排、拷貝數異常及核糖核酸（RNA）表達異常等廣義的基因突變。
本指導原則的技術要求是基于熒光探針PCR方法確立的，對于高分辨熔解曲線PCR方法、Luminex平臺或核酸檢測芯片等其他基于PCR的分子生物學檢測技術，可能部分要求不完全適用或本指導原則所述技術指標不夠全面，申請人可以根據實際產品特性選擇適合的方法或補充需要的評價和驗證，但需闡述不適用的理由，并驗證其科學合理性，同時確認性能評價的充分性。本指導原則所涉及試劑的方法學不包括熒光原位雜交（Fluorescence in situ Hybridization，FISH）、核酸序列測定、染色體核型分析及免疫組化技術等用于腫瘤個體化治療指導的其他方法學。本指導原則適用于進行首次注冊申報和相關許可事項變更的產品。
二、注冊申報資料要求
（一）綜述資料
綜述資料主要包括產品預期用途、產品描述、有關生物安全性的說明、研究結果的總結評價以及同類產品上市情況介紹等內容，其中同類產品上市情況介紹部分應著重從方法學及不同基因突變類型檢出能力等方面寫明擬申報產品與目前市場上已獲批準的同類產品之間的主要區別。若尚無同品種批準上市，則應詳細論述作為檢測靶標的突變基因與個體化治療方案的相關性，說明理論依據。
提交的資料應符合《體外診斷試劑注冊管理辦法（試行）》（國食藥監械〔2007〕229號）（以下簡稱《辦法》）和《體外診斷試劑注冊申報資料基本要求》（國食藥監械〔2007〕609號）的相關要求。
（二）產品說明書
說明書承載了產品預期用途、標本采集及處理、實驗方法、檢測結果解釋以及注意事項等重要信息，是指導實驗室工作人員正確操作、臨床醫生針對檢驗結果給出合理醫學解釋的重要依據，因此，產品說明書是體外診斷試劑注冊申報最重要的文件之一。產品說明書的格式應符合《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》的要求，境外試劑的中文說明書除格式要求外，其內容應盡量保持與原文說明書的一致性，翻譯力求準確且符合中文表達習慣。產品說明書中相關技術內容均應與申請人提交的注冊申報資料中的相關研究結果保持一致，如某些內容引用自參考文獻，則應以規范格式對此內容進行標注，并單獨列明文獻的相關信息。
結合《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》的要求，下面對腫瘤個體化治療相關基因突變檢測試劑說明書的重點內容進行詳細說明，以指導注冊申報人員更合理地完成說明書編制。需要強調的是，產品說明書內容應與申請人前期完成的分析性能評估、穩定性研究、臨床實驗研究等技術資料完全一致。
1.【預期用途】
應至少包括以下幾部分內容：
1.1臨床背景的介紹，包括相關適用人群特征、腫瘤的組織類型、適用的樣本類型、待測靶基因序列的特征及選擇依據，靶基因及其表達蛋白在惡性腫瘤發生、發展過程中可能起到的作用，相關藥物或其他治療技術及其作用機理、與待測突變位點可能存在的關系等。
如申報試劑未與具體治療方案聯合進行相應的臨床試驗研究，關于靶基因突變與腫瘤疾病及治療方案的相關性描述僅僅來自診療指南、書籍、文獻等資料，則在本項下應注明參考資料的出處，預期用途的相關表述中不應涉及具體藥物產品（商品）名稱、生產企業信息等，并注明未將該產品與具體藥物聯合進行臨床試驗，僅針對靶基因突變的檢測性能進行了驗證；若已將試劑盒與具體藥品聯合進行了相關臨床試驗，并證明其具有指導治療的臨床意義，則可在此明確具體藥物，并在說明書中對相關的臨床研究情況進行簡介。
1.2試劑盒用于特定腫瘤患者人群，通過檢測人體樣本提取的核酸組分中是否存在靶基因突變，對臨床上特定腫瘤患者的個體化治療提供參考意見。腫瘤的類別及適用樣本類型應結合實際的臨床研究完成情況進行確認。
1.3明確說明該試劑盒僅用于對特定腫瘤患者靶基因序列的檢測，其檢測結果僅供臨床參考，不應作為患者個體化治療的唯一依據，臨床醫生應結合患者病情、藥物適應癥、治療反應及其他實驗室檢測指標等因素對檢測結果進行綜合判斷。
2.【檢驗原理】
2.1對試劑盒檢測能夠覆蓋的所有突變位點或突變類型進行詳細描述（靶序列長度、基因座位、突變類型及相關特征等），對引物及探針設計、不同樣品反應管組合、對照品設置及熒光信號檢測原理等進行逐項介紹。
2.2核酸分離/純化方法、原理等。
2.3試劑盒技術原理的詳細介紹，建議結合適當圖示進行說明。如添加了相關的防污染組分（如尿嘧啶DNA糖基化酶，即UDG/UNG等），也應對其作用機理作適當介紹。
3.【主要組成成份】
3.1詳細說明試劑盒內各組分的名稱、數量、內容物、比例或濃度等信息，陰性/陽性對照品（或質控品）可能含有生物源性物質的組分，應說明其生物學來源、活性及其他特性；說明不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。
3.2試劑盒中不包含但對該項檢測必須的組分，企業應列出相關試劑/耗材的名稱、注冊證號（如有）及其他必要的信息。
3.3如果試劑盒中不包含用于核酸分離/純化的試劑組分，則應在此注明經驗證后推薦配合使用的商品化核酸分離/純化試劑盒的生產企業、產品名稱以及該產品的醫療器械注冊證號（如有）等詳細信息。
4.【儲存條件及有效期】
試劑盒的效期穩定性、開瓶穩定性、復溶穩定性、運輸穩定性、凍融次數要求等。
5.【適用儀器】
所有適用的儀器型號，并提供與儀器有關的重要信息以指導用戶操作。
6.【樣本要求】
重點明確以下內容：
6.1對適用的樣本類型作詳細介紹，包括樣本來源及取材要求、樣本處理方式（如組織樣本的固定及包埋方式）、腫瘤細胞比例等。
樣本的取材及處理方式等若有通用的技術規范或指南，則應遵循，并在此處引用。
6.2樣本處理及保存：核酸分離/純化前樣本的預處理、保存條件及期限（短期、長期）、運輸條件等。
6.3在核酸分離/純化過程結束后，應采用適當方法對分離/純化后的核酸儲備液進行質量控制。比如，采用分光光度計法對分離/純化后的核酸儲備液進行濃度、純度檢測，并依據性能驗證結果在此給出用于擴增試驗的核酸溶液濃度范圍要求。舉例：擴增反應終體系中需要50ng的脫氧核糖核酸（DNA）量，而在終體系中需加入25μL的DNA儲備液，則在DNA分離/純化完成后應將DNA儲備液的濃度調整至2ng/μL的濃度。
如分離/純化后的核酸儲備液質量（如濃度范圍）不符合要求，應重新取材或擴大樣本量再進行核酸分離/純化。
6.4操作過程中各種制備液的穩定性要求，如各類混合液（Mix）、DNA/RNA儲備液、反應終體系等(常溫/冷藏/冷凍/凍融次數限制等）。
7.【檢驗方法】
詳細說明實驗操作的各個步驟，包括：
7.1試劑配制方法、注意事項。
7.2詳述核酸分離/純化的條件、步驟及注意事項。對照品（質控品）應參與樣本核酸的平行提取（如有必要），以對核酸分離/純化環節進行合理的質量控制。
7.3擴增反應前準備：各組分加樣體積、順序、相關注意事項等。
7.4逆轉錄過程（如涉及）的溫度和時間設置、PCR各階段的溫度、時間設置、循環數設置及相關注意事項。
7.5儀器設置：特殊參數，待測基因、內標和對照品的熒光通道選擇等。
8.【參考值（參考范圍）】
參考值（參考范圍）的描述包括基線的確定方法和閾值循環數（Ct）的要求（如適用）。除Ct值要求外，建議結合是否出現典型S形曲線對結果進行判斷。
9.【檢驗結果的解釋】
結合陽性對照、陰性對照以及樣本管中靶基因和內標的檢測結果（Ct值），對所有可能出現的結果組合及相應的解釋進行詳述。如存在檢測灰區，應對灰區結果的處理方式一并詳述。
10.【檢驗方法的局限性】
10.1本試劑盒的檢測結果僅供臨床參考，對患者個體化治療的選擇應結合其癥狀/體征、病史、其他實驗室檢查及治療反應等情況綜合考慮。
10.2陰性結果不能完全排除靶基因突變的存在，樣本中腫瘤細胞過少、核酸過度降解或擴增反應體系中靶基因濃度低于檢測限亦可造成陰性結果。
10.3腫瘤組織（細胞）可能存在較大異質性，不同部位取樣可能會得到不同的檢測結果。
10.4不合理的樣本采集、轉運及處理，以及不當的試驗操作和實驗環境均有可能導致假陰性或假陽性結果。
10.5明確該檢測僅限于規定的樣本類型及檢測系統（包括適用機型、核酸分離/純化試劑、檢測方法等）。
11.【產品性能指標】
詳述以下性能指標：
11.1對相應國家參考品（如有）檢測的符合情況。
11.2最低檢測限：說明在試劑盒規定的檢測條件及擴增體系中，試劑盒能夠覆蓋的所有突變類別的最低檢出濃度，重點考慮原始模板中突變基因的百分率和擴增終體系中核酸濃度兩個因素對最低檢測限的影響；并簡單介紹最低檢測限的確定方法。
11.3企業內部陽性/陰性參考品符合率，陽性/陰性參考品的組成、來源、濃度梯度設置以及評價標準等信息。
11.4精密度：精密度參考品的組成、來源、濃度梯度要求及評價標準，不同濃度精密度參考品的檢測結果（變異系數）。
11.5分析特異性
11.5.1野生型驗證：應采用不同濃度的野生型核酸樣本進行驗證，其結果應均為陰性。
11.5.2試劑盒內交叉反應：如考核試劑包括對多個突變位點的檢測，則應對該試劑盒覆蓋范圍內的所有突變類型間進行交叉反應驗證。
11.5.3序列相近或具有一定同源性的其他較常見突變或野生型基因序列間的交叉反應驗證。
11.5.4潛在干擾物質驗證。
如果經驗證發現某些序列與靶序列的交叉反應出現陽性結果，則應該對存在交叉反應的核酸序列及濃度進行驗證并在產品說明書中表明這種假陽性發生的可能，做出相關的提示。
11.6對比試驗研究（如有）：簡要介紹參比試劑（方法）的信息、所采用的統計學方法及統計分析結果。
12.【注意事項】
應至少包括以下內容：
12.1如該產品含有人源或動物源性物質，應給出具有潛在感染性的警告。
12.2臨床實驗室應嚴格按照《醫療機構臨床基因擴增實驗室管理辦法》（衛辦醫政發〔2010〕194號或現行有效版本）等有關分子生物學實驗室、臨床基因擴增實驗室的管理規范執行。
（三）擬定產品標準及編制說明
擬定產品標準應符合《辦法》和《體外診斷試劑注冊申報資料基本要求》（國食藥監械〔2007〕609號）的相關規定。另外，對于國產試劑，應參考《中國生物制品規程》（2000年版），將申報產品的主要原材料、生產工藝及半成品檢定等內容作為附錄附于標準正文后，并在正文的“產品分類”項中引出該附錄內容。附錄中應將待測靶基因的基因位點、引物/探針設計及來源、參考品設置、來源及驗證情況、各種酶的來源、特性及驗證等重點內容予以明確。
腫瘤個體化治療相關基因突變檢測試劑的注冊檢測應主要包括以下性能指標：物理性狀、試劑盒內陰/陽性對照品（質控品）的Ct值要求（包括內標）、陰/陽性參考品符合率、精密度、最低檢測限等。陽性參考品主要考察對試劑盒覆蓋范圍內不同突變基因的檢測符合性，陰性參考品則重點對申報試劑的分析特異性進行驗證。
如果申報試劑已有相應的國家/行業標準發布，則企業標準的要求不得低于國家/行業標準的要求。
（四）注冊檢測
根據《辦法》的要求，首次申請注冊的第三類產品應該在國家食品藥品監督管理總局認可的、具有相應承檢范圍的醫療器械檢測機構進行連續3個生產批次樣品的注冊檢測。對于已經有國家標準品的檢測項目，在注冊檢測時應采用相應的國家標準品進行,對于目前尚無國家標準品的項目，生產企業應建立自己的參考品體系并提供相應的內部參考品。
（五）主要原材料研究資料
應提供主要原材料如引物、探針、企業參考品的選擇與來源、制備過程、質量分析和質控標準等相關研究資料。若主要原材料為企業自己生產，其生產工藝必須相對穩定，并提交工藝驗證報告；如主要原材料購自其他供貨商，應提供的資料包括：供貨方提供的質量標準、出廠檢定報告，以及該原材料到貨后的質量檢驗資料。
1. 核酸分離/純化組分（如有）的主要組成、原理介紹及相關的驗證資料。
2. PCR和/或逆轉錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）組分的主要原料（包括引物、探針、各種酶及其他主要原料）的選擇、制備、質量標準及實驗研究資料，主要包括以下內容：
2.1脫氧三磷酸核苷（dNTP）
核酸的組成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP；應提交對純度、濃度、保存穩定性等的驗證資料。
2.2引物
由一定數量的dNTP構成的特定序列，通常采用DNA合成儀人工合成，合成后經聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）或其他適宜方法純化。需提供對分子量、純度、穩定性、功能性實驗等的驗證資料。如為外購，還應提供合成機構出具的合成產物的質檢證明，如PAGE結果或高效液相色譜法（HPLC）分析圖譜。
2.3探針
特定的帶有示蹤物（標記物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能與互補核酸序列退火雜交，用于特定核酸序列的探測。合成后經聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）或其他適宜方法純化，在5-端(和/或3-端)進行標記，并經HPLC或其他適宜方法純化，純度應達到HPLC純。應提供合成機構出具的合成產物的質檢證明，如HPLC分析圖譜，應對探針的分子量、純度及標記的熒光素進行核實，并進行功能性試驗驗證。
2.4酶
DNA聚合酶，應具有DNA聚合酶活性，無核酸內切酶活性，具熱穩定性，如：94℃保溫1小時后仍保持50%活性；尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG），具有水解尿嘧啶糖苷鍵的活性，無核酸外切酶及核酸內切酶活性；逆轉錄酶，具逆轉錄酶活性，無核酸內切酶活性。應對酶活性進行合理驗證。
3. 核酸類檢測試劑的包裝材料和耗材應無脫氧核糖核酸酶（DNase）和核糖核酸酶（RNase）污染。
4. 企業內部參考品：應詳細說明有關企業內部參考品的原料選擇、制備、定值過程等試驗資料。具體要求如下：
4.1陽性參考品
試劑盒（分型或不分型）所能覆蓋的所有突變位點均應設置相應的陽性參考品，每個突變位點設置至少三個突變百分率梯度，其中需包括至少一份弱陽性參考品。陽性參考品的突變形式及濃度需經過金標準方法或已上市同類分型試劑的確認。
如申報試劑用于DNA樣本的檢測，則陽性參考品可以采用臨床樣本提取的DNA儲備液、相應質粒或細胞系（如有）作為原料。如申報試劑用于RNA樣本的檢測，陽性參考品可以采用臨床樣本提取的RNA儲備液、相應RNA凍干粉或模擬缺陷病毒（假病毒）的形式；如覆蓋突變位點過多，可以對其中部分突變位點采用質粒的形式，但不能全部采用質粒，需包括部分突變類型（申請人自行確定其代表性）RNA為模板的陽性參考品以對逆轉錄（RT）過程進行監控。
4.2陰性參考品
可采用經確認無相應靶突變序列的野生型DNA儲存液。
4.3檢測限參考品
檢測限參考品的原料要求參考陽性參考品，需包括所有的突變類型。在進行最低檢測限性能評估時，應設置多個梯度，主要從擴增反應終體系核酸濃度和突變序列所占百分率兩個方面進行評價，建議采用95%（n≥20）的陽性檢出率作為最低檢測限確定的標準。當設置檢測限參考品時，可以僅設置一個濃度水平，該水平可略高于95%的陽性檢出率水平，而設置為100%檢出，應明確參考品中靶核酸濃度水平和突變百分率。
4.4精密度參考品
精密度參考品原料要求參考陽性參考品，需至少包括弱陽性、中或強陽性水平的精密度驗證，中/強陽性精密度參考品可不必包括所有突變類型，以常見突變類型（申請人自行確定其代表性）為主，但弱陽性參考品需包括所有突變位點；如有必要，建議同時設置陰性參考品精密度驗證。
5. 試劑盒內對照品（質控品）
試劑盒的質控體系通過設置各種試劑盒對照品來實現，質控體系需考慮對樣本核酸分離/純化、配液及加樣、試劑及儀器性能、擴增反應抑制物（管內抑制）、交叉污染、靶核酸降解等因素可能造成的假陰性或假陽性結果進行合理的質量控制。所有陽性對照品的核酸性質應與待測樣本的靶核酸性質一致，如同為DNA或RNA。對照品可采用質粒、假病毒或臨床樣本的核酸提取液等進行配置。申報資料應對試劑盒對照品有關原料選擇、制備、定值過程等試驗資料詳細說明。申請人應視申報產品具體情況設置合理的試劑盒對照品（質控品），試劑盒質控體系主要考慮以下幾方面要求。
5.1陽性對照品（質控品）
建議對每個樣品反應管設置至少一份陽性對照品（質控品），陽性對照品應參與樣本核酸的平行提取（如有必要），以對樣本核酸分離/純化、試劑及儀器性能、擴增反應過程等環節進行質量控制，企業應對各種陽性對照品（質控品）的Ct值做出明確的范圍要求。如樣本反應管內可以覆蓋多種突變序列的檢測（分型或不分型），相應的陽性對照管可以不必涉及所有突變類型，但應選擇較常見突變序列或理論上較難測得的突變序列作為陽性對照。
5.2內對照（內標）
內對照（內標）可以對管內抑制導致的假陰性結果進行質量控制，尤其是靶核酸為RNA、用于基因重排或基因表達異常等檢測目的時，可以采用管家基因或與靶基因濃度水平相當的其他基因序列作為相應的內對照（內標）。申請人應對內對照（內標）的引物、探針和模板濃度做精確驗證，既要保證內標熒光通道呈明顯的陽性曲線又要盡量降低對靶基因檢測造成的抑制而導致假陰性。
5.3陰性對照
陰性對照可以是含有野生型核酸序列的核酸溶液，也可以是空白對照，以對可能存在的交叉污染進行假陽性結果的質控。陰性對照品應參與樣本核酸的平行提取。
由于臨床標本多為經過復雜處理的病理切片或組織，其中核酸的完整性容易被破壞，從而影響后續實驗結果，造成假陰性的可能性。因此，除上述對照品外，申報試劑的反應體系中應充分考慮對核酸分離/純化環節的質量控制，比如，設置專門的質控管對管家基因或其他源于人類基因組DNA的靶序列進行擴增，以對核酸分離/純化的質量及效率進行評估。
（六）主要生產工藝及反應體系的研究資料
生產工藝及反應體系的研究資料應能對反應體系涉及到的基本內容，如臨床樣本用量、試劑用量、反應條件、質控體系設置、Ct（臨界）值確定等，提供確切的依據，配制工作液的各種原材料及其配比應符合要求，原材料應混合均勻，配制過程應對pH、電導率、離子濃度等關鍵參數進行有效控制。主要包括以下內容：
1. 主要生產工藝介紹，可以圖表方式表示。
2. 反應原理介紹。
3. 基因位點選擇、(RT)-PCR方法學特性介紹。
4. 確定最佳(RT)-PCR反應體系的研究資料，包括酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度等。
5. 確定逆轉錄過程（如涉及）的溫度和時間的研究資料，PCR反應各階段溫度、時間及循環數的研究資料。
6. 對于基線閾值（threshold）和閾值循環數（Ct）確定的研究資料。
7. 不同適用機型的反應條件如果有差異應分別詳述。
8. 如申報產品包含核酸分離/純化試劑，應提交對核酸分離/純化過程進行工藝優化的研究資料。
（七）分析性能評估資料
企業應提交在產品研制階段對試劑盒進行的所有性能驗證的研究資料，包括具體研究方法、內控標準、實驗數據、統計分析等詳細資料。若試劑用于RNA樣本檢測，則在性能評估中（除非特別說明）需對所有突變位點均采用RNA樣本，從而對逆轉錄過程進行驗證。
建議著重對以下分析性能進行研究。
1. 樣本核酸分離/純化
樣本核酸的分離/純化主要有以下目的：富集靶核酸濃度、保證靶核酸序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除PCR抑制物，樣本核酸分離/純化是決定后續核酸擴增過程成敗的要素之一。尤其是石蠟包埋組織樣本在福爾馬林固定過程中，會使樣品中的核酸與核酸之間，核酸與蛋白之間發生交聯，并且樣本在不當的保存條件下容易造成核酸的片段化或降解，增加了核酸分離/純化的難度。因此，無論申報產品是否含有核酸分離/純化的組分，企業都應對核酸分離/純化的環節做充分的驗證。除最大量分離出目的核酸外，還應有相應的純化步驟，盡可能去除PCR抑制物。常見的核酸分離純化均有其優勢和不足，申請人應結合申報產品的特性，合理選擇核酸分離/純化試劑，并提供詳細的驗證資料。
2. 陽性/陰性參考品符合率
各水平、各突變位點的陽性參考品均應按要求檢出陽性，考慮到濃度梯度的不同，應對各水平陽性參考品設置相應Ct值的限制；陰性參考品在各個引物探針組合的檢測條件下均應檢出為陰性；如有野生型參考品的設置，在其相應的引物探針組合下檢測應為陽性。
3. 最低檢測限
建議采用95%（n≥20）的陽性檢出率作為最低檢測限確定的標準，擴增反應終體系中的突變序列百分率和總核酸濃度兩個因素對最低檢測限的影響較大，終體系中突變序列的百分率越高、所含的DNA（RNA）量越多，則越容易檢出。因此，試劑盒最低檢測限主要考慮以下兩種情形。
3.1在擴增反應終體系特定核酸濃度下，突變序列所占百分率的最低檢測限。
采用野生型臨床樣本和較高突變百分率的臨床樣本提取的核酸儲備液進行混合，確定擴增反應終體系中的核酸濃度，采用合理的試驗方法（如深測序）對混合后樣本中突變序列所占百分率進行確認，并逐漸調整野生型和突變型核酸儲備液的比例以得到含不同突變序列百分率的混合液。如上述方法不易實現，也可采用含相應突變類型的質粒與野生型基因組DNA（或野生型質粒）混合的方法來制備相應的混合液。對各份混合液進行不少于20次的重復檢測，確定95%陽性檢出率水平，作為在固定的核酸濃度條件下，可以檢測到的最低的突變序列百分率。
舉例：在50ng/40μL水平，可以達到95%陽性檢出率的最低突變序列百分率為10%。
3.2在特定突變序列百分率下，反應終體系中核酸濃度的最低檢測限。
采用合理的實驗方法確定待測樣本中的突變序列所占的百分率，或采用突變型質粒與野生型基因組DNA（或野生型質粒）按一定比例混合（如固定在10%的水平），再逐級稀釋成不同核酸濃度樣本，分別對各梯度濃度樣本進行不少于20次的重復檢測，確定95%陽性檢出率的最低DNA（RNA）濃度。
舉例：在10%的突變序列百分率水平，40μL擴增反應終體系中，DNA濃度的最低檢測限為50ng/40μL。
3.3建議評價腫瘤細胞比例、DNA（RNA）降解等因素對最低檢測限可能造成的影響。
4. 分析特異性
4.1野生型驗證：采用不同濃度的野生型核酸樣本進行驗證，結果應為陰性。
4.2交叉反應，對于此類產品的交叉反應驗證主要考慮以下幾方面情形：
4.2.1申報試劑所覆蓋的全部突變類型間的交叉反應；
4.2.2核酸序列相近或具有同源性、易引起交叉反應的野生型或其他突變類型序列間的交叉反應。
申請人應提供所有用于交叉反應驗證的突變或野生型序列來源、序列確認和濃度選擇等試驗資料。有關交叉反應驗證的信息應在產品說明書的【產品性能指標】項中有所體現。
4.3干擾物質
4.3.1申請人應根據試劑盒所采用的樣本類型，確定潛在的干擾物質。
4.3.2用于干擾試驗的樣本，靶基因濃度應至少包含弱陽性，而不應僅選擇強陽性樣本，使用醫學相關水平的干擾物質進行驗證。此外，建議申請人同時在每種干擾物質的潛在最大濃度(“最差條件”)條件下同樣進行評價。
有關干擾物質的研究結果亦應總結于產品說明書的【產品性能指標】項下。
5. 精密度
測量精密度的評價方法并無統一的標準可依，可根據不同產品特征或企業的研究習慣進行，前提是必須保證研究的科學合理性。具體實驗方法可以參考國際或國內有關體外診斷產品性能評估的文件進行。企業應對每項精密度指標的評價標準做出合理要求，如標準差或變異系數的范圍等。針對本類產品的精密度評價主要包括以下要求。
5.1對可能影響檢測精密度的主要變量進行驗證，除申報試劑（包括核酸分離/純化組分）本身的影響外，還應對PCR分析儀、操作者、地點等要素進行相關的驗證。
5.2合理的精密度評價周期，例如：為期至少20天的連續檢測，每天至少由2人完成不少于2次的完整檢測，從而對批內/批間、日內/日間以及不同操作者之間的精密度進行綜合評價。如有條件，申請人應選擇不同的實驗室進行重復實驗以對室間精密度進行評價。
5.3用于精密度評價的參考品應至少包括弱陽性參考品和高濃度參考品2個水平，如有必要，建議同時設置陰性參考品進行驗證，要求如下:
5.3.1陰性參考品：待測靶核酸濃度低于最低檢測限或為零濃度，建議選用背景值較高的陰性樣本，陰性符合率應為100%（n≥20）。
5.3.2弱陽性參考品：待測靶核酸濃度略高于試劑盒的最低檢測限，陽性檢出率應達到100%（n≥20）。（弱陽性參考品需包括所有的突變位點，如果待測物靶核酸為RNA，則弱陽性精密度參考品中應至少部分典型突變位點的原料為RNA，如RNA干粉或相應的假病毒）
5.3.3高濃度參考品：待測靶核酸呈中到強陽性的濃度，陽性檢出率為100%且CV≤15%（n≥20）。（如果試劑盒可以覆蓋多個突變位點的檢測，該參考品可以設置為對全部突變位點進行精密度驗證，也可以選擇其中部分突變位點進行驗證，但應至少包含常見突變序列或理論上較難測得的突變序列）
6. 其他需注意問題
對于適用多個機型的產品，應提供如產品說明書【適用儀器】項中所列的所有型號儀器的性能評估資料。若試劑盒適用的樣本類型不止一種，如既包含石蠟包埋組織切片亦包含冷凍組織切片或血液樣本等，則需對所有樣本類型的適用性進行評估，并提交評估資料。
（八）參考值（參考范圍）確定資料
對于此類試劑，參考值確定資料主要是指Ct值的確認資料，建議申請人采用受試者工作特征（ROC）曲線的方式對申報產品用于結果判斷的臨界值予以確認。
（九）穩定性研究資料
穩定性研究資料主要涉及兩部分內容，申報試劑的穩定性和適用樣本的穩定性研究。前者主要包括效期穩定性（有效期）、開瓶穩定性、復溶穩定性、運輸穩定性及凍融次數限制等研究，申請人可根據實際需要選擇合理的穩定性研究方案。穩定性研究資料應包括研究方法的確定依據、具體的實施方案、詳細的研究數據以及結論。對于效期穩定性研究，應提供至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。
另外，樣本穩定性的研究對于實驗的成敗也至關重要。特別是當使用標本類型包括組織標本時，腫瘤組織標本經過特殊處理后其核酸序列的完整性容易遭到破壞，因此應提供對樣本保存條件、保存時間等方面的詳細研究資料。樣本穩定性研究主要包括核酸分離/純化前樣本穩定性和分離/純化后核酸在儲備液中的穩定性兩方面。在合理的溫度范圍內選擇多個溫度點（應至少包括范圍的上限和下限溫度），每間隔一定的時間段即對儲存樣本進行分析驗證，從而確認不同類型樣本的穩定性。適于冷凍保存的樣本還應對凍融次數進行評價。
試劑穩定性和樣本穩定性兩部分內容的研究結果均應在說明書【儲存條件及有效期】和【樣本要求】兩項中進行詳細說明。
（十）臨床試驗研究
對于國內外尚無同類產品被批準上市或無充足資料證明其臨床預期用途的新型腫瘤相關基因突變，相關檢測試劑的臨床研究不能單純采用對比試驗的方法，而應將試劑盒臨床研究納入相關藥物的臨床研究或臨床應用中，通過對特定的腫瘤病人進行治療前后的跟蹤隨訪，以臨床對于患者個體化治療方案及有效性的綜合判斷為金標準，評價此類試劑用于指導腫瘤個體化治療的臨床性能。其中，有關診斷試劑臨床研究的臨床試驗資料應符合《辦法》、《體外診斷試劑注冊申報資料基本要求》（國食藥監械〔2007〕609號）以及《體外診斷試劑臨床研究技術指導原則》的要求。
對于已有同類產品上市的、基因突變類型與腫瘤個體化治療方案的相關性已經得到確認的產品，則申請人既可采用試劑盒檢測與相關藥物治療相結合對特定的腫瘤病人進行治療前后的跟蹤臨床研究的方法，亦可在充分結合相關的病例信息的情況下，采用考核試劑與參比方法進行對比試驗的研究方法，對考核試劑的臨床應用有效性進行評價。
以下要求均針對采用對比試驗方法的臨床研究提出。
1. 參比方法的選擇可以考慮以下幾方面：
1.1如已有同類產品上市，其臨床研究可以選擇境內已批準上市、臨床普遍認為質量較好的同類產品作為參比試劑，采用擬申報產品（以下稱考核試劑）與之進行對比試驗研究，證明本品與已上市產品等效或優于已上市產品。但應充分考慮已上市同類試劑的突變位點選擇、靶序列選擇、最低檢測限等特性，確保考核試劑與申報試劑具有明確可比性。
1.2申請人亦可采用核酸序列測定方法作為此類試劑臨床試驗研究的參比方法，驗證考核試劑檢測結果與核酸序列測定（測序）結果之間的一致性情況。臨床研究報告中應對選用的測序方法作詳細介紹，并對委托測序服務的機構（如涉及）資質和選擇依據作簡要說明或提供相關資料。
申請人應提供以下關于測序部分的詳細試驗資料，需有臨床試驗單位或委托測序服務機構的簽章確認。
1.2.1測序方法原理、測序儀型號、測序試劑及消耗品的相關信息。
1.2.2測序方法所用引物相關信息，如基因區段選擇，分子量、純度、功能性實驗等資料。引物設計應合理涵蓋考核試劑擴增的靶核酸區段、位點、及所有突變類型。
1.2.3對所選測序方法的分析性能進行合理驗證，尤其是最低檢測限的確認，建議將所選測序方法與申報試劑的相關性能進行適當比對分析。
1.2.4測序方法應建立合理的陽性質控品和陰性質控品對臨床樣本的檢測結果進行質量控制。
1.2.5提交有代表性的樣本測序圖譜及結果分析資料。
1.3此外，在充分考慮檢測結果具有明確可比性的前提下，也可以選擇熒光原位雜交（FISH）或免疫組化等染色體或蛋白水平的檢測技術作為參比方法，但考慮到檢測結果之間不具有直接的可比性，建議對所有陽性病例采用其他分子生物學技術（如核酸序列測定）對結果予以確認。測序部分資料的提交參考上一條要求。
2. 臨床研究單位的選擇
建議申請人在選擇臨床單位時，應在國內不同區域選擇臨床單位，盡量使各單位的臨床樣本有一定的區域代表性；臨床研究單位應具有分子病理診斷和分子生物學方法檢測的優勢，實驗操作人員應有足夠的時間熟悉檢測系統的各環節（儀器、試劑、質控及操作程序等），熟悉評價方案。在整個實驗中，考核試劑和參比方法都應處于有效的質量控制下，最大限度保證試驗數據的準確性及可重復性。
3. 臨床試驗方案
臨床試驗實施前，研究人員應從流行病學、統計學、臨床醫學、檢驗醫學等多方面考慮，設計科學合理的臨床研究方案。各臨床研究機構的方案設置應基本一致，且保證在整個臨床試驗過程中遵循預定的方案實施，不可隨意改動。整個試驗過程應在臨床研究機構的實驗室內并由本實驗室的技術人員操作完成，申報單位的技術人員除進行必要的技術指導外，不得隨意干涉實驗進程，尤其是數據收集過程。
試驗方案中應確定嚴格的病例納入/排除標準，任何已經入選的病例再被排除出臨床研究都應記錄在案并明確說明原因。在試驗操作過程中和判定試驗結果時應采用盲法以保證試驗結果的客觀性。各研究單位選用的參比試劑應完全一致，以便進行合理的統計學分析。臨床方案中還應明確復核試劑及方法。另外，考核試劑適用的樣本類型、可檢測的基因突變類型不應超越參比試劑的相應檢測要求，若此種情況發生，則應選擇其他合理參比方法對額外的樣本類型和基因突變類型進行驗證。
4. 病例選擇及陽性病例比例
臨床試驗應以腫瘤患者為研究對象，其中試劑盒規定范圍的每種突變類型均應有一定量的陽性病例。對于陰性病例的選擇，也應考慮到交叉反應驗證的需要，以從臨床角度考察其分析特異性。陰/陽性病例均應覆蓋所有適用的腫瘤類型。若產品適用于多種樣本類型，則應對所有樣本類型均進行臨床驗證。
5. 統計學分析
對臨床試驗結果的統計應選擇合適的統計方法，如檢測結果一致性分析、受試者工作特征（ROC）曲線分析、陰性/陽性符合率等。對于本類產品對比實驗的等效性研究，常選擇交叉四格表的形式總結兩種試劑的定性檢測結果，對定性結果進行四格表χ2檢驗或kappa檢驗以驗證兩種試劑定性結果的一致性，統計分析應可以證明兩種方法的檢測結果有無明顯統計學差異。在臨床研究方案中應明確統計檢驗假設，即評價考核試劑與參比試劑是否等效的標準。
6. 結果差異樣本的驗證
在數據收集過程中，對于兩種方法檢測結果不一致的樣本，應采用“金標準”方法或臨床上普遍認為質量較好的第三種同類試劑進行復核，同時結合患者的臨床病情對差異原因及可能結果進行分析。
7. 臨床試驗總結報告撰寫
根據《體外診斷試劑臨床研究技術指導原則》的要求，臨床試驗報告應該對試驗的整體設計及各個關鍵點給予清晰、完整的闡述，應該對整個臨床試驗實施過程、結果分析、結論等進行條理分明的描述，并應包括必要的基礎數據和統計分析方法。建議在臨床總結報告中對以下內容進行詳述。
7.1臨床試驗總體設計及方案描述
7.1.1臨床試驗的整體管理情況、臨床研究單位選擇、臨床主要研究人員簡介等基本情況介紹。
7.1.2病例納入/排除標準、不同年齡段人群的預期選擇例數及標準。
7.1.3樣本類型，樣本的收集、處理及保存等。
7.1.4統計學方法、統計軟件、評價統計結果的標準。
7.2具體的臨床試驗情況
7.2.1臨床研究所用產品的名稱、批號、有效期及所用機型等信息，以及對比試驗產品的注冊情況。
7.2.2對各研究單位的病例數、年齡分布情況進行綜合分析，建議以列表或圖示方式給出具體例數及百分比。
7.2.3質量控制，試驗人員培訓、儀器日常維護、質控品運行情況，對檢測精密度、質控品測量值的抽查結果評估。
7.2.4具體試驗過程，樣本檢測、數據收集、樣本保存、結果不一致樣本的校驗等。
7.3統計學分析
7.3.1數據預處理、差異數據的重新檢測或第三方驗證以及是否納入最終數據統計、對異常值或缺失值的處理、研究過程中是否涉及對方案的修改。
7.3.2陽性符合率、陰性符合率、總體符合率。
7.3.3以交叉四格表的形式總結兩種試劑的定性檢測結果，對定性結果進行四格表χ2檢驗或kappa檢驗以驗證兩種試劑定性結果的一致性。
另外考慮到對不同樣本類型以及不同年齡段人群的檢測結果可能存在一定差異，故建議對不同樣本類型及不同年齡段人群分別進行統計分析，以對考核試劑的臨床性能進行綜合分析。
7.4討論和結論
對總體結果進行總結性描述并簡要分析試驗結果，對本次臨床研究有無特別說明，最后得出臨床試驗結論。
三、名詞解釋
1. 聚合酶鏈式反應 polymerase chain reaction, PCR：
聚合酶鏈式反應或多聚酶鏈式反應是一種對特定的DNA或RNA片段在體外進行快速擴增的方法。由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成。
2. 雜交 hybridization
具有一定同源序列的兩條核酸單鏈（DNA或RNA）可以通過氫鍵的方式，按堿基互補配對原則相結合。
3. 熒光探針PCR
在PCR過程中利用熒光標記的特異性探針，對PCR產物進行標記跟蹤，釋放的熒光能量的變化直接反映出PCR擴增產物量的變化，并通過對熒光的采集和分析以達到對原始模板量進行分析的PCR。
4. 分析特異性 analytical specificity
測量程序只測量被測量物的能力。分析特異性用于描述檢測程序在樣本中有其他物質存在時只測量被測量物的能力。通常以一個被評估的潛在干擾物清單來描述，并給出在特定醫學相關濃度值水平的分析干擾程度。（潛在干擾物包括干擾物和交叉反應物）
5. 精密度 precision
在規定條件下，相互獨立的測試結果之間的一致程度。精密度的程度是用統計學方法得到的測量不精密度的數字形式表示，如標準差（SD）和變異系數（CV）。
6. 檢測限 detection limit, limit of detection
樣品中以一定概率可被聲明與零有差異的被測測量的最低值。
7. 閾值循環數 cycle threshold, Ct
實時監測擴增過程中，反應管內的熒光信號到達指數擴增時經歷的循環周期數。主要的計算方式是以擴增過程前3到15個循環的熒光值的10倍標準差為閾值，當熒光值超過閾值時的循環數則為閾值循環數（Ct）。
8. 突變 mutation
是細胞中DNA核苷酸序列發生了穩定的可遺傳的改變。
9. 內標 internal control
在同一反應管中與靶序列共同擴增的一段非靶序列分子，其目的是鑒別儀器故障、試劑因素、聚合酶活性因素或樣本中存在抑制物等造成的結果不理想的原因。
四、參考文獻
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腫瘤個體化治療相關基因突變檢測試劑
技術審查指導原則編制說明
一、背景信息
近年來，腫瘤的治療取得了相當大的進展，然而，在腫瘤的治療中，無論是療效還是毒性反應都存在較大的個體差異。即使是同一個部位的腫瘤，相同的治療方法對不同的個體也會導致不同的治療結果。如用于治療非小細胞型肺癌的藥物吉非替尼，絕大多數的非小細胞肺癌病人對吉非替尼無反應，但約10%的病人對吉非替尼表現出快速且非常顯著的療效。研究發現，EGFR基因18-21號外顯子序列發生突變后會使吉非替尼的療效更好。在臨床上通過檢測腫瘤患者，腫瘤組織中基因突變靶點及基因單核苷酸序列多態性（SNP）分型、基因重排、基因拷貝數異常、核糖體核糖核酸（mRNA）表達異常等為臨床提供個體化治療的依據，能顯著提高治療的效率，降低藥物的毒副作用。目前用于腫瘤個體化治療相關基因突變的檢測還有：CYP2C19基因檢測、HER-2基因檢測、K-ras基因檢測等。進行腫瘤個體化治療的基礎和前提是腫瘤分子靶標檢測結果的準確性。多種原因會影響檢測結果的準確性，包括檢測試劑的方法學上的局限性，檢測試劑原材料的設計和選擇等，除此之外，樣本質量對檢測結果也有影響，如：樣本中核酸的分離/純化過程、樣本中不可避免的一些干擾物質等。假陽性的檢測結果不僅使患者的治療達不到預期的效果，還會使病人承受不必要的痛苦；而假陰性的檢測結果會給臨床醫生錯誤的用藥指導，使病人錯過最佳的治療時機，最終導致病人病情的惡化，甚至死亡。因此相關的生產企業必須充分意識到該類產品的潛在風險，根據本指導原則的要求對該類試劑的安全性和有效性進行科學合理的驗證。
腫瘤個體化治療相關基因突變檢測試劑是指利用基于聚合酶鏈式反應（PCR）方法的核酸檢測技術，以腫瘤個體化治療相關的突變基因為檢測目標，對人體樣本（包括組織、體液等）提取的核酸組份中的目標序列進行體外檢測的試劑。
二、編制目的
目前，涉及腫瘤個體化治療相關基因突變檢測試劑研制及注冊申報的生產企業眾多，但不同廠家的產品在擴增引物、熒光探針的設計及臨床驗證等方面差異較大，分析性能明顯不一，雖然《體外診斷試劑注冊管理辦法（試行）》（以下簡稱《辦法》）、《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》、《體外診斷試劑臨床研究指導原則》等體外診斷試劑法規文件對該類試劑的注冊申報資料提出了原則性要求，但在技術審評環節中仍然遇到許多細節性技術問題有待統一。隨著技術審評工作的不斷積累，對該類產品的技術要求以及存在問題也逐漸明確，因此，有必要制定相關的技術指導原則對這些共性問題進行總結規范。
本指導原則旨在讓申請人明確審評部門對本類試劑重點關注的內容、規范注冊申請人對注冊申報資料的準備及撰寫、解釋企業在注冊申報過程中對一些常見問題的疑惑、盡量減少技術審評環節的注冊資料補充，同時有利于規范技術審評要求，統一審評尺度。本文內容不包括注冊審批的行政事項，亦不作為法規強制執行。企業在實際操作過程中可以采用其他合理方式，但應有充分的證據說明其所用方法可以有力保證試劑的安全有效性。
三、重點技術問題的說明
（一）產品說明書中針對【預期用途】、【樣本要求】、【檢驗方法】、【檢驗結果的解釋】及【檢驗方法的局限性】等項目增加了有關腫瘤個體化治療相關基因突變檢測的特殊說明。在【樣本要求】部分對本類試劑在檢測過程中所需樣本的特殊要求及對樣本處理過程的質量控制進行了明確，在【檢驗方法的局限性】部分，專門對由于非試劑原因造成的假陽性或假陰性結果進行了可能性的分析。
（二）主要原材料的研究資料中包含內對照。
內對照（內標）可以對管內抑制導致的假陰性結果進行質量控制，尤其是靶核酸為RNA、用于基因重排或基因表達異常等檢測目的時，可以采用管家基因或與靶基因濃度水平相當的其他基因序列作為相應的內對照（內標）。申請人應對內對照（內標）的引物、探針和模板濃度做精確驗證，既要保證內標熒光通道呈明顯的陽性曲線又要盡量降低對靶基因檢測造成的抑制而導致假陰性。
（三）明確提出對樣本核酸分離純化的要求。
樣本核酸的分離/純化主要有以下目的：富集靶核酸濃度、保證靶核酸序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除PCR抑制物，樣本核酸分離/純化是決定后續核酸擴增過程成敗的要素之一。尤其是石蠟包埋組織樣本在福爾馬林固定過程中，會使樣品中的核酸與核酸之間，核酸與蛋白之間發生交聯，并且樣本在不當的保存條件下容易造成核酸的片段化或降解，增加了核酸分離/純化的難度。因此，無論申報產品是否含有核酸分離/純化的組分，企業都應對核酸分離/純化的環節做充分的驗證。除最大量分離出目的核酸外，還應有相應的純化步驟，盡可能去除PCR抑制物。常見的核酸分離純化均有其優勢和不足，申請人應結合申報產品的特性，合理選擇核酸分離/純化試劑，并提供詳細的驗證資料。
（四）分析特異性包括野生型驗證和交叉反應兩部分，前者為采用不同濃度的野生型核酸樣本進行驗證，結果應為陰性。后者主要包括以下兩個方面，其一，申報試劑所覆蓋的全部突變類型間的交叉反應；其二，核酸序列相近或具有同源性、易引起交叉反應的野生型或其他突變類型序列間的交叉反應。申請人應提供所有用于交叉反應驗證的突變或野生型序列來源、序列確認和濃度選擇等試驗資料。有關交叉反應驗證的信息應在產品說明書的【產品性能指標】項中有所體現。
（五）陽性/陰性參考品。
如申報產品有相應的國家參考品，則企業內部陽性/陰性參考品應參考國家參考品的項目設置。在不低于國家參考品要求的前提下，申請人可以結合實際情況設置合理的企業內部陽性/陰性參考品。對于沒有國家參考品的產品，申請人應根據產品性能驗證的實際情況自行設定企業內部參考品，應著重考慮試劑盒（分型或不分型）所能覆蓋的所有突變位點均應設置相應的陽性參考品，每個突變位點設置至少三個突變百分率梯度，其中需包括至少一份弱陽性參考品。陽性參考品的突變形式及濃度需經過金標準方法或已上市同類分型試劑的確認。
（六）臨床試驗參比方法的選擇可以是境內已批準上市、臨床普遍認為質量較好的同類產品作為參比試劑，也可選擇核酸序列測定方法作為此類試劑臨床試驗研究的參比方法。此外，在充分考慮檢測結果具有明確可比性的前提下，也可以選擇熒光原位雜交（FISH）或免疫組化等染色體或蛋白水平的檢測技術作為參比方法，但考慮到檢測結果之間不具有直接的可比性，建議對所有陽性病例采用其他分子生物學技術（如核酸序列測定）對結果予以確認。測序部分資料的提交參考上一條要求。
（七）病例選擇及陽性病例比例。臨床試驗應以腫瘤患者為研究對象，其中試劑盒規定范圍的每種突變類型均應有一定量的陽性病例。對于陰性病例的選擇，也應考慮到交叉反應驗證的需要，以從臨床角度考察其分析特異性。陰/陽性病例均應覆蓋所有適用的腫瘤類型。若產品適用于多種樣本類型，則應對所有樣本類型均進行臨床驗證。
四、編寫單位
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